Ang diskarteng patch-clamp ay ang pangalang ibinigay sa isang diskarteng pagsukat ng electrophysiological. Pinapayagan nitong masukat ang mga ionic na alon sa pamamagitan ng mga indibidwal na channel sa loob ng isang lamad ng plasma.
Ano ang pamamaraan ng patch-clamp?
Ang pamamaraan ng patch clamp o pamamaraan ng patch clamp ay kabilang sa electrophysiology, na kung saan ay isang sangay ng neurophysiology na nakikipag-usap sa electrochemical transmission ng mga signal sa nervous system. Sa tulong ng pamamaraang ito, posible na mailarawan ang mga indibidwal na channel ng ion sa lamad ng cell ng isang cell ng katawan. Nagsasangkot ito ng pagsukat ng mga alon ng ilang mga picoamperes. Ang pamamaraan ng patch-clamp ay unang inilarawan noong 1976 ng German biophysicist na si Erwin Neher at ng Aleman na manggagamot na si Bert Sakmann. Ang dalawang siyentipiko ay iginawad sa Nobel Prize sa Physiology o Medicine noong 1991 para sa pagbuo ng clamp-patch technique. Samakatuwid, ang pagsasaliksik sa electrophysiological ay halos binago ng pamamaraan ng patch-clamp sapagkat binuksan nito ang posibilidad na obserbahan ang pag-uugaling elektrikal sa lamad proteins ng indibidwal molecule. Ang term na patch ay nagmula sa wikang Ingles at nangangahulugang "patch". Ito ay tumutukoy sa isang maliit na seksyon ng lamad sa ilalim ng patch pipette, na ginagamit bilang isang pagsukat ng elektrod. Sa panahon ng proseso ng pagsukat, ang patch ng lamad ay naayos o naka-clamp (upang i-clamp) sa tinukoy na mga potensyal.
Pag-andar, epekto at mga layunin
Ang pamamaraan ng patch-clamp ay isang pamamaraan ng pagsusuri sa electrophysiological. Ito ay batay sa biological na katotohanan na ang mga cell ay may isang malaking bilang ng mga pores at ion channel. Ang iba't ibang mga konsentrasyon ng ion o singil ay nangyayari sa loob at labas ng bawat cell, na nakasalalay sa estado ng physiological ng cell. Ang lipid bilayer ng lamad ay hindi permeable sa tubig molecule pati na rin ang mga ions. Gayunpaman, ang isang palitan ng mga sisingilin na mga maliit na butil ay nagaganap sa buong lamad ng cell sa iregular na agwat. Ang dahilan para dito ay ang pag-asa ng boltahe ng mga ion channel. Kung naabot ang isang potensyal na lamad, ang mga channel ay bubuksan alinsunod sa prinsipyo ng "lahat o wala". Dito mismo pumapasok ang diskarte sa patch clamp. Sa ganitong paraan, ang isang sumusukat na pipette ay isinusulong sa isang ion channel nang hindi tumagos sa lamad ng cell. Sa ganitong paraan, ang lokal na potensyal na elektrikal ay maaaring matukoy nang tumpak. Ang mga alon ng tagas, na maaaring makaapekto sa resulta ng pagsukat, ay karaniwang maiiwasan ng mga kuryenteng sobrang masikip na koneksyon sa pagitan ng gilid ng pipette at ng lamad ng cell. Ang pamamaraan ng patch clamp ay batay sa diskarteng boltahe na clamp. Ang pamamaraan na ito ay binuo noong 1930s ng American biophysicist na si Kenneth Stewart Cole (1900-1984) upang sukatin ang mga alon sa mga nerve cells na buo. Sa boltahe clamp, ang pagpasok ng dalawang electrode sa isang cell ay nagaganap upang magbigay ng isang utos o boltahe na may hawak. Sa parehong oras, ang isa pang elektrod ay ginagamit upang maitala ang mga alon na naganap sa buong lamad. Kung nais malaman ng mga neurophysiologist tungkol sa daloy ng mga daloy ng kuryente sa pamamagitan ng mga tiyak na lugar ng a mga selula ng nerbiyos lamad, ginagamit nila ang pamamaraan ng patch clamp. Upang magawa ito, gumagamit sila ng isang mahusay na pipette ng baso na inilalagay sa labas ng cell. Ang negatibong presyon ay maaaring malikha sa pamamagitan ng pag-aspirate nito sa tulong ng isang hypodermic syringe. Ang pamamaraang ito ay nagdudulot ng lamad na lamad ang lamad sa kaukulang lokasyon. Tinitiyak ng negatibong presyon na nakakabit ang salamin sa lamad. Nagreresulta ito sa paghihiwalay ng kuryente ng maliit na spot ng lamad sa pipette mula sa natitirang lamad. Upang sukatin ang mga daloy ng kuryente, ang mga neurophysiologist ay gumagamit ng isang patch clamp amplifier. Ito ay isang espesyal na aparato sa pagsukat. Sa perpektong kaso, maaaring gamitin ng siyentista ang aparato upang makakuha ng impormasyon tungkol sa mga de-koryenteng katangian ng mga indibidwal na channel ng ion. Ang mga ion channel ay kinokontrol, halimbawa, ang pag-agos at pag-agos ng sosa mga ions, na positibong sisingilin, sa mga nerve cells. Ang pagsisiyasat ay nagaganap sa mga cell ng mga tao, halaman o hayop. Ang pamamaraan ng patch-clamp ay karaniwang ginagawa sa isang istasyon ng pagsukat na may kasamang iba't ibang mga aparato. Sa mesa ng pagsukat ng panginginig ng boses mayroong isang tinatawag na Faraday cage, na nagsisilbing isang electrical Shield. Bukod dito, ang isang optikong mikroskopyo kabilang ang isang micromanipulator ay magagamit upang dalhin ang posisyon sa patch pipette. Bilang karagdagan, ang may hawak ng pipette ay may koneksyon sa isang preamplifier, habang ang sample na may-ari ay konektado sa isang electrode ng paliguan. Gumagana ang patch clamp amplifier upang palakasin ang preamplifier signal. Nagbibigay din ng monitor upang maobserbahan ang DUT pati na rin ang patch pipette. Sa karamihan ng mga kaso, ang isang computer at maraming mga aparato ng imbakan ng data ay magagamit din sa talahanayan ng pagsukat upang paganahin ang digital recording.
Mga panganib, epekto, at panganib
Walang mga panganib na nauugnay sa diskarteng patch-clamp. Halimbawa, ang mga cell mula sa mga tao, hayop, o halaman ay hindi nasusuri hanggang matanggal ang mga ito. Ang walang limitasyong pag-access sa panlabas na lamad ng cell ay bihirang mayroon. Para sa kadahilanang ito, madalas na kinakailangan upang ihanda ang mga cell para sa pamamaraan ng patch-clamp. Matapos punan ang patch pipette, naka-clamp ito sa isang micromanipulator. Nakakonekta ito sa patch clamp amplifier at dahan-dahang pinindot sa isang cell na buo. Ang proseso ay maaaring sundin sa isang monitor o mikroskopyo. Sa ilalim ng pipette nakaupo ang isang piraso ng lamad na tinatawag na isang membrane patch. Ang bahagyang negatibong presyon na nilikha sa likurang dulo ng pipette ay nagbibigay ng isang malakas na koneksyon sa pagitan ng pipette at ng lamad. Ang prosesong ito ay nagreresulta sa paglikha ng isang de-koryenteng paglaban sa pagitan ng panlabas na solusyon at ng panloob na pipette ng maraming gigaohms. Tinutukoy din ito ng mga siyentista bilang "gigaseal," na nagpapahintulot sa pag-configure ng naka-attach na cell na paraan ng patch-clamp na makamit. Ang kasalukuyang dumadaloy sa pamamagitan ng isang ion channel sa patch ay dumadaloy din sa mga nilalaman ng pipette dahil sa mataas na paglaban ng gigaseal. Ang isang elektrod na konektado sa amplifier ay nahuhulog sa solusyon ng pipette, na pinapayagan ang mga aktibidad ng indibidwal na mga channel ng ion sa loob ng sukat ng patch.
